Proclamata come rivelazione scientifica del 2015, la tecnica di editing genomico Crispr sta dando una serie di risultati promettenti in molti campi della biomedicina. Tre diversi studi pubblicati su Science hanno dimostrato che Crispr potrebbe avere un ruolo anche nella lotta contro la distrofia muscolare di Duchenne. La ricercatrice americana Rhonda Bassel-Duby, autrice di uno degli studi, illustrerà questo nuovo filone di ricerca alla XIV Conferenza Internazionale di Parent Project Onlus.
Francesca Ceradini
Da diversi anni gli scienziati che lavorano nel campo della distrofia muscolare di Duchenne stanno puntando a innovative tecniche di terapia genica, o di terapie farmacologiche che vadano ad agire direttamente sul gene, per ripristinare la produzione di distrofina e mantenere così le funzioni muscolari che sono normalmente perse con il progredire della malattia. Le considerevoli dimensioni del gene della distrofina (il più grande del nostro Dna) non permettono però di poter utilizzare la terapia genica “classica”, ovvero l’introduzione nelle cellule muscolari della forma intera del gene. I ricercatori stanno quindi mettendo a punto una serie di strategie alternative, quali l’utilizzo di mini o micro geni della distrofina, la costruzione di cromosomi artificiali contenenti l’intero gene e lo sviluppo di nuove molecole per eliminare l’effetto di specifiche mutazioni. Alcune di queste strategie sono ancora in fase di ricerca di base, altre sono invece già in fasi avanzate della sperimentazione clinica o, addirittura, hanno iniziato il percorso di autorizzazione di immissione in commercio.
In questo fitto panorama di futuribili terapie per la Dmd sta muovendo i suoi primi passi una nuova tecnica di terapia genica basata sull’editing genomico che nonostante la sua giovane età, è stata messa a punto solo tre anni fa, sta entusiasmando la comunità scientifica per le sue enormi potenzialità. La tecnica si chiama Crispr ed è un rivoluzionario “taglia e cuci genetico” che permette di modificare e correggere il Dna con una potenzialità, precisione e versatilità mai viste finora (per un approfondimento della tecnica leggere “Crispr: l’ultima frontiera dell’ingegneria genetica”). Il meccanismo di questa “forbice molecolare” è semplicissimo e si basa sulla combinazione di pochi elementi: la proteina Cas9, che è un enzima in grado di tagliare il Dna, e un Rna guida, molecola disegnata ad hoc in laboratorio, che indirizza il taglio di Cas9 in un punto ben preciso, ad esempio a livello di una mutazione. Nel 2015 sono stati pubblicati diversi interessanti studi per la valutazione del nuovo editing genomico come potenziale trattamento per diverse patologie e, per finire l’anno in bellezza, il 31 dicembre del 2015 sono stati pubblicati contemporaneamente su Science tre diversi lavori che forniscono la prova preliminare che Crispr potrebbe rappresentare una nuova strategia terapeutica per la Duchenne.
In tutti e tre gli studi i ricercatori hanno condotto esperimenti nei topi mdx, i topi modello utilizzati in laboratorio per studiare la distrofia muscolare di Duchenne. Questi topi hanno una mutazione nonsenso nell’esone 23 del gene della distrofina che comporta l’introduzione di un segnale di stop in una zona interna del gene. Questo causa l’interruzione anticipata della lettura del gene e la produzione di una forma più corta, non funzionale, della distrofina. Gli studi si basano sull’utilizzo di Crispr per rimuovere, in maniera specifica, l’esone 23 del gene della distrofina in maniera tale da eliminare la mutazione nonsenso che è alla base dell’insorgenza della distrofia. Alla fine di questa “operazione molecolare” la distrofina prodotta sarà più corta del normale ma potrà ancora svolgere la sua funzione muscolare. Il concetto di base ricorda molto l’exon skipping (approccio che è già approdato alle fasi finali del lungo percorso della sperimentazione clinica), strategia con la quale si fa saltare un esone per ristabilire il corretto schema di lettura del gene della distrofina che è stato scombinato da una mutazione. Ma tra le due tecniche ci sono delle differenze sostanziali. Prima di tutto, l’exon skipping agisce sul Rna messaggero, la molecola che veicola l’informazione genetica nella cellula, mentre Crispr agisce sul Dna, ovvero modifica direttamente il codice genetico. Ciò implica un effetto permanente dell’editing e potrebbe bastare un unico trattamento terapeutico, mentre l’exon skipping è una terapia che va ripetuta nel tempo (i trial clinici in corso sono condotti con somministrazioni settimanali). Dopodiché, l’exon skipping è un approccio mutazione specifico mentre Crispr è più versatile, può funzionare per un gran numero di mutazioni, includendo anche le delezioni di più esoni. Infine l’editing genomico si è rivelato essere una tecnica molto precisa ma allo stesso tempo facile ed economica.
Ma vediamo ora cosa hanno dimostrato questi tre nuovi promettenti lavori sulla Duchenne.
Nel primo studio, condotto nel laboratorio di Eric Olson al Southern Medical Center della Texas University di Dallas e guidato da Rhonda Bassel-Duby, i ricercatori hanno inizialmente testato Crispr eliminando l’esone 23 (e quindi la mutazione nonsenso) direttamente sugli zigoti mdx, ovvero sulle cellule uovo fecondate di topi mdx. I risultati hanno mostrato che ben l’80% dei nuovi topi nati hanno il gene della distrofina mancante dell’esone 23, il che rappresenta un’altissima efficienza di editing, e che questi topi producono distrofina con un netto recupero della forza muscolare rispetto ai topi progenitori. Utilizzare l’editing genomico sulle cellule germinali o sugli embrioni non è però ancora progettabile sull’uomo, i ricercatori hanno quindi indirizzato il loro studio sul tessuto muscolare di topi mdx appena nati. I componenti Cas9 e Rna guida, disegnata ad hoc per tagliare via l’esone 23, sono stati veicolati nelle cellule muscolari mediante un vettore adenovirus-associato (AAV9). Il vettore virale è stato somministrato in tre diversi modi: per via intramuscolare (somministrazione locale), per via intra-peritoneale (somministrazione sistemica, ovvero via circolazione sanguigna) e per via retro-orbitale (una seconda via sistemica). Tutti e tre i metodi hanno dimostrato un’alta efficienza di editing con l’eliminazione dell’esone 23, una produzione della distrofina (con valori che vanno dal 20% fino al 60% nel caso della somministrazione per via intramuscolare), una diminuzione di necrosi e d’infiammazione del tessuto muscolare e, infine, un significativo incremento della forza muscolare dei topi. Questi risultati sono stati evidenziati sia a livello dei muscoli scheletrici che del muscolo cardiaco, dimostrando che i componenti di Crispr vengono veicolati nei vari compartimenti del corpo. Un dato negativo è invece l’impossibilità da parte di AAV9 di attraversare la barriera emato-encefalica e quindi l’assenza di produzione di distrofina nel cervello. Per quel che riguarda invece i possibili tagli “off-target”, ovvero i tagli non previsti in punti non desiderati del gene, i dati sono molto confortanti: i ricercatori non hanno individuato nessun evento rilevante.
Il secondo studio, pubblicato dal team di Charles Gersbach della Duke University di Durham, ha riportato risultati molto simili a quelli appena descritti. In questo caso i ricercatori hanno utilizzato come vettore dei componenti Cas9 e Rna guida l’adenovirus-associato (AAV8) che hanno iniettato per via intra-peritoneale o per via intramuscolare in topi mdx appena nati e adulti. Gli esperimenti hanno mostrato che fino al 67% delle miofibre sono in grado di produrre distrofina.
Infine, nel terzo studio, guidato da Amy Wagers della Harvard University, è stato ancora una volta utilizzato il vettore AAV9 contenente i componenti di Crispr per l’eliminazione dell’esone 23 in topi mdx. In questo caso, utilizzando dei marcatori cellulari fluorescenti i ricercatori hanno analizzati gli effetti dell’editing genomico nelle cellule satelliti, le cellule progenitrici delle cellule muscolari che hanno un ruolo determinante nel processo di rigenerazione muscolare. I risultati hanno dimostrato che Crispr è in grado di agire anche sulla popolazione di cellule satelliti e che queste mantengono la loro capacità rigenerativa, un dato fondamentale perché ciò permette che l’effetto terapeutico dell’editing si possa mantenere nel tempo.
I lavori pubblicati su Science rappresentano un’importante prova preliminare per l’utilizzo di Crispr come possibile terapia per la distrofia muscolare di Duchenne. I risultati ottenuti dai tre diversi laboratori dimostrano che questo sistema di editing è in grado di eliminare in maniera efficiente la mutazione presente sul gene della distrofina in topi mdx, con la conseguente produzione di buoni livelli della distrofina stessa e un incremento della forza muscolare dei topi. Diversi studi precedenti hanno dimostrato che basterebbe un 10% di produzione di distrofina per attenuare i sintomi della Duchenne e che con un 30% si potrebbe arrestare la malattia. Le analisi effettuate negli esperimenti descritti mostrano che con l’utilizzo di Crispr si può arrivare a superare il 50% di distrofina, un risultato notevole. Inoltre, il fatto che la proteina è espressa sia nel tessuto muscolare scheletrico sia nel diaframma e nel cuore, è un dato cruciale visto che la principale causa di morte prematura nei ragazzi con la Duchenne deriva da insufficienza respiratoria o scompensi cardiaci.
Tutti questi dati messi insieme rendono Crispr un nuovo approccio terapeutico molto promettente. La tecnica può essere applicata a diversi tipi di mutazioni e i ricercatori hanno stimato che l’80% circa della popolazione Duchenne potrebbe trarre benefici dall’editing genomico, un numero entusiasmante. Ora la scommessa più grande è riuscire ad arrivare alla sperimentazione sull’uomo, la strada è ancora lunga, la tecnica deve essere ulteriormente valutata, ottimizzata e riprodotta su nuovi animali modello, ma la comunità scientifica confida nel fatto che sarà una strada che porterà lontano.