La tecnica di editing genomico nota come CRISPR è un approccio rivoluzionario per il trattamento delle malattie genetiche. Tuttavia, questa metodologia deve ancora essere messa a punto prima di arrivare a una possibile applicazione sull’uomo. Un team di ricercatori statunitensi ha identificato e superato un ostacolo della tecnica che potrebbe gettare le basi per future possibili terapie per la DMD. Lo studio è stato pubblicato lo scorso dicembre sulla rivista scientifica “Journal of Clinical Investigation Insight”.
Il meccanismo di azione di Crispr/Cas9 si basa su due elementi: un enzima deputato al taglio del DNA (Cas 9) e una molecola guida (gRNA) che indica il punto preciso in cui tagliare. La tecnica è stata infatti paragonata a una forbice veicolata da un sistema GPS. Lo scopo è di correggere le mutazioni presenti sul gene della distrofina e di indurre così la produzione della proteina che è assente nella DMD. Per effettuare questa “operazione genetica” il sistema Crispr/Cas9 viene veicolato nell’organismo mediante gli stessi vettori virali utilizzati per la terapia genica (gli AAV, virus adeno-associati). La differenza rispetto alla terapia genica è che con l’editing non serve veicolare un “gene terapeutico” all’interno delle cellule, bensì si veicola il sistema di “correttore di bozze” che va a modificare il gene direttamente dove si trova. I diversi studi preclinici effettuati fino a oggi per la Duchenne sono stati condotti rimuovendo alcune mutazioni presenti nel gene della distrofina su cellule prelevate da pazienti DMD, su topi o cani modello per la distrofia muscolare. Nel caso della distrofia muscolare di Duchenne, il compito è particolarmente difficile perché le possibili mutazioni sono migliaia e occorre quindi un metodo di editing estremamente flessibile.
Per studiare le potenzialità del sistema Crispr/Cas9 per la DMD il gruppo di ricerca guidato da Dongsheng Duan, presso la School of Medicine dell’Università del Missouri, ha condotto gli esperimenti su topi mdx, il modello murino per la distrofia muscolare di Duchenne. I ricercatori hanno somministrato CRISPR per via endovenosa in topi di 6 settimane e hanno seguito gli effetti fino all’età di 18 mesi. Inizialmente hanno utilizzato il protocollo standard, ovvero somministrando le molecole Cas9 e gRNA in proporzioni uguali. Una prima analisi dei risultati ha mostrato buoni risultati a breve termine (nel periodo successivo al trattamento) ma scarsi risultati a lungo termine (a 18 mesi). In quest’ultimo caso, non è stato evidenziato alcun ripristino della distrofina nel muscolo scheletrico, è stato evidenziato un basso livello di ripristino nel cuore e il trattamento non è riuscito a rallentare la progressione della malattia. Durante la revisione dei risultati il team ha evidenziato un deperimento sproporzionato di gRNA (è stato osservato che la quantità di Cas9 era fino a 6-7 volte maggiore di quella di gRNA) il che significa che le molecole guida non sono sufficienti per dire a Cas9 dove tagliare. Fenomeno che spiega bene i risultati ottenuti: il sistema di editing mostra una buona efficienza nel breve periodo successivo alla somministrazione ma i suoi benefici non riescono a perdurare nel tempo in tutti i muscoli del corpo. I ricercatori hanno quindi deciso di modificare il protocollo sperimentale, incrementando la quantità di gRNA rispetto a quella di Cas9. Questa nuova strategia ha aumentato significativamente il ripristino della distrofina nel muscolo scheletrico e cardiaco e ridotto la fibrosi muscolare nei topi a 18 mesi. Risultati che si sono tradotti in un miglioramento della funzione muscolare e cardiaca.
“Crispr essenzialmente elimina la mutazione e ricuce il gene”, ha detto Duan. “Per fare questo, le forbici molecolari devono sapere dove tagliare. Il punto preciso di taglio è contrassegnato da una molecola “bandiera” chiamata gRNA. Siamo stati sorpresi di scoprire che aumentando la quantità di bandiere, potremmo estendere l’efficacia della terapia dai tre ai 18 mesi nel nostro modello murino”. Questi risultati suggeriscono che la quantità di gRNA è un fattore limitante per la terapia sistemica a lungo termine con Crispr. “Abbiamo dimostrato che questa barriera può essere superata aumentando e ottimizzando le dosi di gRNA. Questo rappresenta un’interessante prospettiva di miglioramento per le strategie terapeutiche nel campo della Duchenne e riteniamo che possa avere implicazioni importanti nell’uso di CRISPR per una serie di differenti patologie”.
Il gruppo di Duan ha inoltre indagato su un ulteriore importante problema dell’editing: la possibilità da parte di Cas9 di compiere errori sistematici tagliando in altri siti del DNA e causando così effetti inaspettati (i cosiddetti effetti off-target). I ricercatori hanno perciò eseguito un sequenziamento approfondito sui siti target e sui siti off-target previsti da un algoritmo apposito. Il team ha riportato nella pubblicazione scientifica di non aver trovato modifiche significative di tipo “off-target”. I ricercatori continueranno a testare e perfezionare l’approccio nel topo prima di passare ad altri modelli animali. Sono fiduciosi che, con ulteriori studi, questa intuizione possa aiutare a gettare le basi per allargare gli orizzonti dell’editing genomico nel campo della DMD.
A cura dell’Ufficio Scientifico Parent Project onlus
Potete scaricare la pubblicazione scientifica al seguente link