Si è svolta dal 22 al 25 luglio, in forma virtuale, la Conferenza di Parent Project Muscular Dystrophy, l’associazione statunitense di pazienti e genitori di figli con DMD/BMD.
Tra i temi della quarta e ultima giornata dell’evento troviamo quello dell’editing genomico. Di seguito condividiamo con voi un video ed un report elaborati da Ilaria Zito dell’area Scienza di Parent Project aps per un approfondimento su questo tema.
Conferenza Parent Project Muscular Dystrophy (PPMD) 2020: gli aggiornamenti sulle strategie emergenti per la Duchenne: l’editing genomico
Report della quarta giornata della Conferenza di Parent Project Muscular Dystrophy (22-25 luglio 2020), l’associazione statunitense di pazienti e genitori di figli con DMD/BMD.
Si è conclusa sabato 25 luglio la quarta e ultima giornata della conferenza annuale di Parent Project Muscular Dystrophy (PPMD) 2020. La sessione scientifica con la quale si sono chiusi i lavori è una sessione dal titolo “Strategie emergenti nella Duchenne”, che guarda al futuro della patologia. Nello specifico si è parlato di editing genomico con CRISPR-Cas9.
Melissa Spencer – Co-direttore del Centro per la distrofia muscolare di Duchenne presso la UCLA (Los Angeles, CA) – ha fatto una ricca e chiara introduzione sulla strategia. Nella seconda parte di questa sessione si è aperta la discussione in cui Melissa Spencer e Kevin Flanigan – Nationwide Children’s Hospital (Columbus, OH) – hanno risposto alle domande facendo chiarezza soprattutto sulle principali problematiche legate alla strategia.
Cos’è l’editing genomico.
L’editing genomico consente di poter effettuare una modifica precisa nel DNA all’interno di cellule viventi. È una tecnica che si basa sull’utilizzo di due semplici elementi. Il primo è una molecola guida (gRNA), costituita da una sequenza di RNA disegnata per riconoscere una specifica regione del DNA su cui si vuole attuare la modifica e a cui la molecola guida si lega. Il secondo è la cosiddetta forbice molecolare, costituita da un enzima (Cas9) che è in grado di tagliare il DNA, nel punto preciso dove la molecola guida l’ha indirizzato.
Due meccanismi per la strategia:
Esistono due meccanismi diversi. Il primo, più semplice, è il cosiddetto non-homologous end-joining (NHEJ, o saldatura delle estremità non omologhe) in cui le estremità generate dal taglio operato dal cas9 vengono semplicemente ricongiunte.
La seconda, definita homology directed repair (HDR o riparazione assistita da stampo) richiede un terzo componente che funziona da stampo per andare a ricreare la sequenza di DNA in maniera corretta. In questo caso il gene viene riparato e non semplicemente tagliato.
Sfortunatamente il secondo meccanismo, che lavora su cellule in attiva divisione, non è efficiente nelle cellule del muscolo scheletrico. Al momento quindi, per le strategie che mirano al trattamento della DMD, si sta lavorando allo sviluppo di piattaforme NHEJ.
Editing genomico ed exon-skipping, omologie e differenze:
Le strategie di editing genomico per la DMD mirano dunque a ripristinare lo schema di lettura del gene, in maniera simile a quello che viene fatto con le strategie di exon skipping, saltando uno o più esoni. Per fare ciò si utilizzano di preferenza due molecole guida che riconoscono due regioni di DNA intronico che si trovano a monte e a valle dell’esone (o degli esoni) da saltare.
La differenza principale rispetto all’exon skipping è che l’editing genomico è permanente in quanto agisce sul DNA all’interno del nucleo della cellula, mentre l’exon skipping agisce sull’RNA. Questo comporta un grande vantaggio in quanto non c’è bisogno di somministrazioni ripetute settimanalmente, ma teoricamente basterebbe un unico dosaggio.
Editing genomico e terapia genica, omologie e differenze:
Per poter raggiungere il tessuto di interesse, nel nostro caso tutti i muscoli incluso il cuore, i due elementi (gRNA e cas9) hanno bisogno di un veicolo (o vettore). I veicoli che sono attualmente in fase di studio per questa strategia sono simili ai vettori che in uso nei trial di terapia genica. Si tratta di vettori virali e, più specificamente, di vettori che utilizzano virus adeno-associati (AAV).
Rispetto alle strategie di terapia genica, l’editing genomico agisce sul DNA endogeno, ossia il DNA che si trova all’interno dei nuclei delle cellule del corpo, mentre sappiamo che la terapia genica prevede il trasferimento di un gene dall’esterno (il cosiddetto transgene) che non viene incorporato nel DNA del paziente ma rimane nel nucleo. Ciò fa si che, essendo il gene della DMD molto grande e i vettori virali utilizzati molto piccoli, il transgene deve essere ridotto notevolmente nelle sue dimensioni per poter essere inserito nel virus e trasferito al paziente, arrivando a una dimensione che è il 30-40% circa di quella originale. Con il CRISPR c’è la possibilità di mantenere regioni più estese di distrofina perché quello che si inserisce nel vettore sono i due elementi: la guida e la forbice molecolare. Inoltre, il fatto di agire sul DNA endogeno è benefico perché si sfruttano gli stessi elementi naturali che regolano l’espressione della distrofina.
A che punto siamo oggi con l’editing genomico?
Nel 2018 è uscita una pubblicazione su Science, in cui E. Olson (UT Southwestern Medical Center – Dallas, TX) e collaboratori hanno osservato il ripristino dell’espressione di distrofina in modelli animali di DMD tramite editing genomico.
Il problema legato alle dimensioni e l’efficacia della strategia:
Abbiamo visto che con l’editing genomico non ci sono i problemi di dimensione che si hanno con la terapia genica, perché quello che inseriamo nel vettore sono la molecola guida e il Cas9. Esistono differenti tipi di enzima Cas9 che derivano da diversi batteri. Quello su cui si è lavorato inizialmente è una molecola molto grande, che ha reso necessario l’utilizzo di un sistema a due vettori virali, uno in cui inserire la guida e uno in cui inserire l’enzima. Questo, se da una parte comporta uno svantaggio in termini di quantità di virus da somministrare e di conseguente carica virale presente nell’ospite con i relativi potenziali effetti sulla risposta immunitaria, dall’altro consente di poter dosare diverse quantità dei due elementi. Questo è un vantaggio in quanto si è visto che la possibilità di poter fornire molecole guida in eccesso aumenta l’efficacia della strategia. Le molecole guida tendono infatti ad andare perdute col tempo, è dunque importante fornirne in quantità sufficienti per raggiungere un gran numero di nuclei di ciascuna fibra muscolare, per proteggere la fibra stessa dall’andare incontro a morte e perdere di conseguenza anche i nuclei che hanno subito l’editing.
L’efficacia è cruciale in questa strategia perché al momento, ricordiamo, si tratta di una strategia che prevede una singola somministrazione (one-shot therapy).
Problematiche legate alla risposta immunitaria e agli off-target:
Le problematiche legate alla risposta immunitaria per questa strategia sono molto simili a quelle che si stanno osservando e studiando nella terapia genica e dalla quale tutto ciò che si sta imparando tornerà sicuramente molto utile alla strategia di editing genomico. Abbiamo un ulteriore problematica derivante dall’utilizzo di Cas9, che è una proteina di origine batterica per la quale l’organismo umano potrebbe rispondere mettendo in atto una risposta immunitaria.
Tuttavia, il problema più importante da affrontare quando si parla di CRSIPR-Cas9 è il problema degli off-target.
Gli off-target sono delle sequenze che possono trovarsi su un punto qualsiasi del genoma umano e che potrebbero avere un’omologia (anche solo quasi perfetta) con la molecola guida. L’eventuale appaiamento della molecola guida con una di queste regioni che non è la regione per cui il sistema è stato disegnato, comporterebbe un taglio ulteriore che potrebbe dimostrarsi dannoso e, ricordiamo, permanente, qualora la sequenza riconosciuta per esempio cadesse all’interno di un gene onco-soppressore. E’ cruciale la scelta della guida e la ricerca di regioni del DNA molto specifiche con poche omologie di sequenza nel resto del genoma, questo si può fare a livello empirico cercando di calcolare il numero di off-target all’interno del genoma rispetto a una specifica molecola guida.
Quando potremmo vedere l’editing genomico in un paziente Duchenne?
Questa è una domanda critica, più che lecita, alla quale è molto difficile dare una risposta. Si sta imparando in corso d’opera e cercando di capire come prevenire e superare tutti i problemi di delivery, di tossicità, di immunità, di efficacia, di off-target. Sicuramente si sta imparando molto anche dalle altre strategie, soprattutto dalla terapia genica, e si potrà imparare anche da altre malattie per le quali l’editing genomico potrebbe arrivare prima. Auspicabilmente non siamo nell’ordine di grandezza di decenni, ma sicuramente abbiamo ancora anni davanti a noi.
A cura dell’Ufficio Scientifico di Parent Project aps
Potete ascoltare la quarta giornata della Conferenza di Parent Project Muscular Dystrophy relativa agli studi clinici qui descritti al seguente link a partire dal minuto 8:44:55
Potete ascoltare gli ultimi aggiornamenti relativi agli studi clinici per la DMD sul nostro nuovo portale dedicato alle strategie terapeutiche.