L’utilizzo di cellule di Sertoli microincapsulate nella distrofia muscolare di Duchenne. Verso l’applicazione sui pazienti.

Titolare del progetto: Guglielmo Sorci, Università di Perugia
Durata: 2 anni
Importo: 108.500 euro

Progetto finanziato da Parent Project aps

Mettere a punto una “micro-bioindustria” basata sulle cellule di Sertoli per combattere il processo infiammatorio e degenerativo del tessuto muscolare nella DMD. Questa è l’idea di partenza dello studio guidato da Guglielmo Sorci dell’Università di Perugia. Il progetto, della durata di due anni e finanziato da Parent Project onlus, ha come obiettivo di studiare alcuni parametri chiave della strategia per poter valutare un passaggio dagli studi preclinici alla sperimentazione clinica su pazienti.

Le cellule di Sertoli sono cellule presenti nel testicolo e hanno notoriamente una proprietà anti-infiammatoria e immuno-modulatoria. Queste costituiscono una barriera che separa il compartimento delle cellule germinali (le cellule riproduttive) da quello sanguigno, e la loro funzione fisiologica è di proteggere le cellule germinali in via di sviluppo dall’attacco del sistema immunitario che le riconosce come cellule estranee all’organismo. Le cellule di Sertoli sono già state utilizzate in diversi modelli sperimentali di patologie, ad esempio per proteggere i trapianti allogenici dalla risposta del sistema immunitario che ne può causare il rigetto o, nel caso dell’Alzheimer e del Parkinson, per la loro capacità di produrre diversi fattori che creano un ambiente regolatorio adeguato a livello del sistema nervoso centrale.

Nel caso della distrofia muscolare di Duchenne, l’idea è di sfruttare le proprietà delle cellule di Sertoli per combattere il processo infiammatorio del tessuto muscolare. Gli studi eseguiti dal gruppo di ricerca di Sorci si basano su di un complesso protocollo: le cellule di Sertoli vengono isolate dai testicoli di maialini, allevati in condizioni particolari per non presentare fattori patogeni pericolosi per l’uomo, purificate e successivamente inglobate in microcapsule di alginato per uso clinico. Quest’ultima parte è effettuata grazie alla collaborazione con il gruppo di ricerca di Riccardo Calafiore e Giovanni Luca, sempre dell’Università di Perugia. Le microcapsule vengono quindi inoculate nella parete addominale (in particolare nella cavità peritoneale) di topi modello per la distrofia muscolare. Le analisi effettuate dopo tre settimane hanno mostrato che una singola inoculazione di cellule di Sertoli è in grado di indurre una forte riduzione della componente infiammatoria dei muscoli con una evidente diminuzione dell’area fibrotica e necrotica del tessuto. È stata inoltre osservata anche l’induzione di utrofina – una proteina simile alla distrofina, normalmente prodotta solo durante lo sviluppo fetale, la cui produzione viene attualmente utilizzata come strategia sperimentale per la Duchenne – nelle fibre muscolari, un risultato inatteso e sorprendente. Studi approfonditi hanno successivamente dimostrato che le cellule di Sertoli rilasciano una proteina chiamata eregulinab1 che è un potente induttore dell’espressione dell’utrofina. Dal punto di vista funzionale è stato osservato che i topi inoculati hanno un importante recupero della performance muscolare, paragonabile a quella dei topi sani. Gli effetti benefici di una singola inoculazione di cellule di Sertoli sono evidenti anche a lungo termine, dopo cinque mesi dall’inoculazione, e si riscontrano anche a livello del diaframma.

Le microcapsule rimangono fluttuanti nella cavità peritoneale e si comportano come una “micro-bioindustria”: liberano importanti fattori, tra cui quelli anti-infiammatori, che dalla cavità peritoneale passano nel circolo sanguigno e raggiungono ogni singolo muscolo. Si tratta quindi di un modello che potrebbe rappresentare un’innovativa strategia per combattere il processo infiammatorio muscolare tipico della Duchenne. Il trattamento non richiede alcuna immunosoppressione farmacologica ed è indipendente dal tipo di mutazione alla base della patologia. Per quel che riguarda le sperimentazioni cliniche, le cellule di Sertoli (non incapsulate) sono già state trapiantate all’interno di un dispositivo nella parete addominale di soggetti con diabete di tipo 1, senza complicazioni evidenti in un follow-up a 7 anni. La procedura di microincapsulamento delle cellule di Sertoli in alginato è ad oggi brevettata.
A questo punto, il progetto finanziato da Parent Project onlus – con avvio dal 1° marzo 2017, della durata di due anni e con un costo di 108.500 € – ha come obiettivo l’analisi di tutta una serie di parametri chiave per poter valutare e progettare il passaggio dagli studi preclinici alla sperimentazione clinica.

Di seguito i principali punti dello studio:

Finora per tutti gli studi condotti nei vari sistemi modello è stata utilizzata la stessa dose di cellule di Sertoli. Una serie di dati indicano però che anche una dose inferiore ha la stessa efficacia, da qui l’esigenza di determinare quale sia la dose minima efficace.
Valutare, nel tempo, lo stato biologico delle cellule di Sertoli contenute nelle capsule. Ovvero, capire se le cellule vanno incontro a divisione cellulare, a morte cellulare o ad altri eventi, e valutare con quali tempistiche. Questi processi potrebbero in qualche modo influenzare l’azione delle cellule stesse. Tecnicamente le capsule si possono facilmente recuperare dalla cavità intraperitoneale e analizzare. Ad oggi è noto che le cellule di Sertoli microencapsulate sono vitali fino a 12 mesi dal trapianto.
Analizzare se le cellule di Sertoli sono in grado di agire anche direttamente sui mioblasti (i precursori muscolari). È possibile che, oltre all’azione anti-infiammatoria e di induzione dell’utrofina, le cellule di Sertoli abbiano un effetto anche sulla proliferazione e sul differenziamento dei mioblasti e quindi sull’intera struttura del tessuto muscolare. Alcuni dati preliminari hanno già dato delle indicazioni in tal senso.
Studiare più nel dettaglio gli effetti delle cellule di Sertoli sulla componente infiammatoria della Duchenne e sulla regolazione dell’utrofina.
Dimostrare che l’effetto delle cellule sia effettivamente di tipo immuno-modulatorio e non immunosoppressivo. Punto fondamentale per non mettere a rischio il sistema immunitario del paziente durante l’eventuale trattamento.
Dimostrare, in via definitiva, il meccanismo di azione delle cellule di Sertoli e testare la sicurezza dell’approccio terapeutico in modelli animali.

Approfondimento

Primo Report

REPORT DI 1° ANNO DEL PROGETTO DI RICERCA “UTILIZZO DI CELLULE DI SERTOLI MICROINCAPSULATE NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE. VERSO L’APPLICAZIONE SUI PAZIENTI”

Si è concluso il primo anno dello studio guidato dal Prof. Sorci, dell’Università di Perugia, e finanziato da Parent Project onlus. Riportiamo di seguito i primi risultati che ci sono stati forniti dal gruppo di ricerca.

Le cellule di Sertoli (SeC) sono cellule presenti nel testicolo e hanno notoriamente una proprietà anti-infiammatoria e immuno-modulatoria. Queste costituiscono una barriera che separa il compartimento delle cellule germinali (le cellule riproduttive) da quello sanguigno, e la loro funzione fisiologica è di proteggere le cellule germinali in via di sviluppo dall’attacco del sistema immunitario che le riconosce come cellule estranee all’organismo. La capacità delle SeC di secernere fattori trofici e immunomodulatori è stata sfruttata con successo in numerosi approcci terapeutici in modelli sperimentali di diverse patologie, come il diabete, il morbo di Parkinson e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA).

Gli studi eseguiti dal gruppo di ricerca di Sorci si basano su un complesso protocollo: le SeC vengono isolate dai testicoli di maialini, purificate, e successivamente inglobate in microcapsule di alginato per uso clinico. Le microcapsule (SeC-MC) vengono quindi inoculate nella cavità peritoneale di topi distrofici (mdx). Dati precedenti hanno dimostrato che, a seguito di un singolo inoculo, le SeC-MC hanno portato ad un miglioramento della morfologia muscolare, con riduzione della necrosi e dell’infiammazione, traducendosi in un recupero della funzionalità muscolare sia nella fase acuta che in quella cronica della patologia. Questi effetti delle SeC sui muscoli distrofici sono dovuti a due principali meccanismi d’azione: da un lato, il rilascio di fattori antiinfiammatori ed immuno-modulatori è responsabile della riduzione dell’infiammazione; dall’altro, il rilascio di una proteina chiamata eregulinab1 induce nelle fibre muscolari l’espressione di utrofina, una proteina simile alla distrofina la cui produzione viene attualmente utilizzata come strategia sperimentale per la Duchenne. Il protocollo proposto non richiede alcuna immuno-soppressione farmacologica ed è indipendente dal tipo di mutazione alla base della patologia.

Il progetto finanziato da Parent Project Onlus mira a favorire un eventuale trasferimento del protocollo all’applicazione sull’uomo. I principali obiettivi sono: una conoscenza più dettagliata della biologia delle SeC all’interno delle microcapsule, uno studio dose-risposta per individuare la dose minima efficace di SeC-MC, indagare in dettaglio il meccanismo d’azione alla base degli effetti benefici indotti dalle SeC, dimostrare l’effetto immuno-modulatorio e non immunosoppressivo delle SeC, e dimostrare la sicurezza di trattamenti con SeC-MC a lungo termine.

Durante il primo anno di attività di ricerca il gruppo di ricerca dell’Università di Perugia ha ottenuto i seguenti risultati:

Le cellule incapsulate potrebbero andare incontro a divisione cellulare, a morte cellulare o ad altri eventi che ne potrebbero in qualche modo influenzare l’azione. Pertanto, le microcapsule pronte per l’inoculo nella cavità peritoneale sono state analizzate al microscopio elettronico. I dati ottenuti dimostrano che la procedura di inclusione non altera la morfologia e la vitalità delle SeC in esse contenute.
Con esperimenti di co-coltura, in cui vengono messi in coltura i miotubi (i precursori delle fibre muscolari) insieme alle SeC, è stato dimostrato che le SeC sono capaci di indurre l’espressione di utrofina anche in miotubi di cani distrofici (GRMD) e di pazienti DMD con diversi tipi di mutazione nel gene della distrofina, con lo stesso meccanismo dimostrato in precedenza nei topi mdx.
I ricercatori hanno dimostrato che le SeC sono in grado di proteggere i miotubi dall’atrofia indotta artificialmente in vitro con diversi metodi (privazione di nutrienti, agenti pro-infiammatori e atrofizzanti, corticosteroidi), rivelando un’ulteriore potenzialità di queste cellule.
È stato osservato che topi inoculati con SeC-MC nella cavità peritoneale e, successivamente, inoculati con cellule tumorali mostrano una ridotta atrofia muscolare indotta dal cancro rispetto ai topi di controllo, che hanno ricevuto l’inoculo tumorale ma non le SeC.
Allo stesso modo, è stato osservato che topi inoculati con SeC-MC nella cavità peritoneale che erano stati precedentemente infettati con Aspergillo, il fungo che più comunemente colpisce i soggetti immunodepressi, rispondono meglio e debellano l’infezione prima dei topi di controllo (infettati con Aspergillo ma non inoculati con SeC). Questi dati, insieme a quelli ottenuti nel punto precedente con le cellule tumorali, dimostrano che la presenza delle SeC-MC non compromette la risposta immunitaria nei topi, confermando un loro ruolo immuno-modulatorio ma non immunosoppressivo.
I ricercatori hanno, infine, dimostrato che anche dosi di SeC-MC più basse rispetto a quelle usate finora sono capaci di dare effetti positivi a livello muscolare una volta iniettate nella cavità peritoneale, rappresentando una condizione vantaggiosa nel caso di un eventuale passaggio all’applicazione sull’uomo.

In attesa di ulteriori dati, i risultati ottenuti supportano un potenziale impiego di SeC-MC in pazienti con distrofia muscolare.

Report Finale

REPORT FINALE DEL PROGETTO DI RICERCA “UTILIZZO DI CELLULE DI SERTOLI MICROINCAPSULATE NELLA DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE. VERSO L’APPLICAZIONE SUI PAZIENTI”

Il progetto, guidato da Guglielmo Sorci dell’Università di Perugia, della durata di due anni e finanziato da Parent Project aps, aveva come razionale quello di valutare l’effetto antiinfiammatorio delle cellule di Sertoli per combattere il processo infiammatorio e degenerativo del tessuto muscolare nella DMD con l’obiettivo di studiare alcuni parametri chiave della strategia per poter valutare il passaggio dagli studi preclinici alla sperimentazione clinica sui pazienti

Il team di Guglielmo Sorci, Professore di Anatomia Umana presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale all’Università di Perugia, conclude il progetto di ricerca da noi finanziato e presenta alla comunità Duchenne un video con i principali risultati. Il progetto ha visto impegnate in tutte le fasi della ricerca sperimentali due giovani e promettenti ricercatrici della stessa università, Sara Chiappalupi e Laura Salvadori, che grazie al progetto hanno usufruito di un assegno di ricerca. Il progetto è iniziato il primo marzo del 2017 e, con un’estensione di pochi mesi per portare a termine il lavoro, è terminato il 28 agosto 2019.

Le cellule di Sertoli (SeC) sono presenti nei tubuli seminiferi del testicolo e hanno due funzioni principali:

separare le cellule germinali in via di sviluppo (quelle cellule che diventeranno spermatozoi) dal letto vascolare. Sono quindi una barriera fisica che impedisce al sistema immunitario di attaccare gli spermatozoi riconosciuti come cellule estranee all’organismo;
secernere fattori trofici (nutritivi) e immunoregolatori, questi ultimi concorrono a bloccare localmente il sistema immunitario che altrimenti attaccherebbe le cellule germinali, riconosciute come estranee.

In questo progetto, le SeC utilizzate sono state prelevate da testicoli di maiali prepuberi. Attualmente si utilizzano cellule di maiali SPF, Specific Pathogens Free, ovvero certificati per assenza di patogeni, idonei anche per trapianti nell’uomo. Le cellule di Sertoli sono state quindi isolate, purificate e incapsulate in alginato di bario, inerte e innocuo per l’uomo (le SeC-MC attualmente sono un prodotto brevettato). Questa importante parte del progetto è stata effettuata grazie alla collaborazione con i professori Giovanni Luca e Riccardo Calafiore dell’Università di Perugia.

Dati precedenti avevano evidenziato, a seguito di un singolo inoculo intraperitoneo di SeC microincapsulate (SeC-MC) nei topi distrofici (mdx), un netto miglioramento della morfologia muscolare, con riduzione della necrosi e dell’infiammazione e con un recupero della funzionalità muscolare sia nella fase acuta che in quella cronica della patologia.

Il gruppo di ricerca ha dimostrato che questi effetti delle SeC sui muscoli distrofici sono dovuti a due principali meccanismi d’azione:

il rilascio di fattori antiinfiammatori e immunomodulatori responsabili della riduzione dell’infiammazione;
il rilascio di una proteina chiamata eregulina beta 1 che, attraverso il sangue, arriva nei muscoli e stimola la produzione di utrofina.
Utrofina e distrofina sono due proteine molto simili che hanno una funzione corrispondente nei muscoli ed è stato dimostrato che l’utrofina può sostituire funzionalmente la distrofina nel topo. Nel muscolo degli adulti l’utrofina è poco espressa mentre sostituisce naturalmente la distrofina nel feto e nella rigenerazione muscolare dopo un danneggiamento.

I principali obiettivi del progetto del gruppo del Professor Sorci erano:

acquisire una conoscenza più dettagliata della biologia delle SeC all’interno delle microcapsule;
effettuare uno studio dose-risposta per individuare la dose minima efficace di SeC-MC;
indagare in dettaglio il meccanismo d’azione alla base degli effetti benefici indotti dalle SeC;
dimostrare l’effetto immunomodulatorio e non immunosoppressivo delle SeC;
dimostrare la sicurezza di trattamenti con SeC-MC a lungo termine

Riassumiamo i principali risultati del progetto:

le cellule incapsulate potrebbero andare incontro a divisione cellulare, a morte cellulare o ad altri eventi che ne potrebbero in qualche modo influenzare l’azione. Pertanto, le microcapsule pronte per l’inoculo nella cavità peritoneale sono state analizzate al microscopio elettronico. I dati ottenuti dimostrano che la procedura di inclusione non altera la morfologia e la vitalità delle SeC in esse contenute;
con esperimenti di co-coltura, in cui vengono messi in coltura i miotubi (i precursori delle fibre muscolari) insieme alle SeC, è stato dimostrato che le SeC sono capaci di indurre l’espressione di utrofina anche in miotubi di cani distrofici (GRMD) e di pazienti DMD con diversi tipi di mutazione nel gene della distrofina, con lo stesso meccanismo dimostrato in precedenza nei topi mdx;
i ricercatori hanno dimostrato che anche dosi di SeC-MC più basse (fino a 10 volte inferiori) rispetto a quelle usate finora sono capaci di fornire effetti positivi a livello muscolare una volta iniettate nella cavità peritoneale, rappresentando una condizione vantaggiosa nel caso di un eventuale passaggio all’applicazione sull’uomo. Hanno quindi evidenziato un miglioramento nella morfologia muscolare, una risoluzione dell’infiammazione e una maggiore espressione di utrofina nei topi distrofici;
in un altro modello animale, il topo mdx/Utrn-/-, che non è in grado di esprimere utrofina, l’inoculo intraperitoneo di SeC ha indotto un miglioramento della morfologia muscolare e una significativa riduzione dell’infiammazione. Ciò sta a indicare che l’effetto antiinfiammatorio indotto dalle cellule di Sertoli è indipendente dalla up-regolazione dell’utrofina, a sua volta indotta dal rilascio della eregulina beta 1;
i ricercatori hanno dimostrato che le SeC sono in grado di proteggere i miotubi dall’atrofia indotta artificialmente in vitro con diversi metodi [privazione di nutrienti, agenti pro-infiammatori e atrofizzanti (citochinine), un glucocorticoide (desametasone)], rivelando un’ulteriore potenzialità di queste cellule;
topi precedentemente iniettati con SeC-MC e successivamente iniettati per via sottocutanea con cellule LLC (carcinoma polmonare di Lewis) o con cellule che provocano melanomi, hanno mostrato una crescita tumorale simile ai topi iniettati con microcapsule vuote (E-MC). Ciò indica che le cellule di Sertoli non hanno attività immunosoppressiva, non influenzano l’insorgenza del tumore e non favoriscono la crescita del tumore stesso. Tuttavia, i topi iniettati con SeC-MC hanno mostrato una significativa riduzione delle metastasi e riduzione generale dell’invasività dei tumori, una minore riduzione del peso corporeo indotta dal tumore nel tempo e una ridotta atrofia muscolare indotta dal cancro, rispetto ai topi di controllo. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che le SeC esercitano un effetto immunomodulatorio anziché immunosoppressivo, supportandone ulteriormente l’uso come potenziale trattamento dei pazienti con DMD;
allo stesso modo, è stato osservato che topi inoculati con SeC-MC nella cavità peritoneale che erano stati precedentemente infettati con Aspergillus fumigatus, il fungo che più comunemente colpisce i polmoni di soggetti immunocompromessi, o con Candida albicans per via intragastrica, rispondono meglio e debellano l’infezione prima dei topi di controllo (infettati con l’agente patogeno ma non inoculati con le SeC-MC), confermando l’effetto immunomodulatorio delle SeC.

Questi dati, insieme a quelli ottenuti nel punto precedente con le cellule tumorali, dimostrano che la presenza delle SeC-MC non compromette la risposta immunitaria nei topi, confermando un loro ruolo immunomodulatore ma non immunosoppressivo. Le cellule di Sertoli non sono quindi immunosoppressive, anzi rilasciano fattori che favoriscono una più rapida risoluzione dell’infezione provocata da diversi agenti patogeni.

A cura dell’Ufficio Scientifico di Parent Project aps